Caracterización de los mecanismos celulares y componentes moleculares involucrados en la señalización y el tráfico del CRHR2α en entornos neuronales
Fil: Armando, Natalia Giannina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; Argentina.
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| Published: |
Universidad Nacional de Quilmes
2021
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ir-20.500.11807-29142023-03-22T15:59:37Z Caracterización de los mecanismos celulares y componentes moleculares involucrados en la señalización y el tráfico del CRHR2α en entornos neuronales Armando, Natalia Giannina Silberstein Cuña, Susana Iris Lorenzano Menna, Pablo Perez Leirós, Claudia Leroux, Alejandro Receptores acoplados a proteínas G Hormona liberadora de corticotropina Urocortina Adenosín monofosfato cíclico Quinasas reguladas por señales extracelulares Neuronas G protein-coupled receptors Corticotropin-releasing hormone Urocortin Cyclic adenosine monophosphate Extracellular signal-regulated kinases Neurons Receptores acoplados à proteína G Hormônio liberador de corticotrofina Monofosfato cíclico de adenosina Quinases reguladas por sinais extracelulares Neurônios Fil: Armando, Natalia Giannina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; Argentina. Fil: Armando, Natalia Giannina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires - Instituto Partner de la Sociedad Max Planck; Argentina. La hormona liberadora de la corticotrofina (CRH) y sus péptidos relacionados, las urocortinas (UCNs) ejercen un rol clave en la respuesta neuroendocrina y comportamental frente al estrés. CRH regula la actividad en el eje hipotalámico-pituitario-adrenal (HPA) y además se encuentra ampliamente distribuido en el sistema nervioso central donde funciona como un neuromodulador, integrando aspectos comportamentales y afectivos de la respuesta a estrés. Por otro lado, las UCNs también se encuentran en el sistema nervioso central, pero su expresión es más restringida en comparación con CRH. Se ha demostrado que la desregulación del sistema CRH/CRHR1, se encuentra asociada a patologías relacionadas con el estrés, la ansiedad y la depresión. Sin embargo, este sistema cuenta también con un receptor de alta afinidad para las UCNs, el CRHR2. Este receptor y el accionar de sus ligandos es un terreno que se encuentra en exploración y del que aún se conoce poco. Tanto el CRHR1 como el CRHR2 son receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) de clase B. Los GPCRs son los mediadores de las respuestas celulares a una gran cantidad de estímulos, lo que los convierte en blanco del estudio de nuevos fármacos para el tratamiento de muchas patologías. Respecto al accionar de los GPCRs, existe una vía canónica donde se acoplan a proteínas G heterotriméricas que, a su vez, desatan la regulación de múltiples proteínas efectoras. Hoy en día se conoce un nuevo paradigma en la señalización de los GPCRs que involucra mecanismos independientes de las proteínas G y la señalización desde endosomas luego de la internalización del receptor. Recientemente, nuestro laboratorio demostró que el CRHR1 mediante la activación por CRH, cumple con el nuevo paradigma en la señalización de los GPCRs. Se sabe que la activación de los receptores de CRH produce un incremento de los niveles intracelulares de AMPc (de sus siglas Adenosín Monofosfato Cíclico), la consecuente activación de la quinasa de proteína A (PKA) y la entrada de calcio. Nuestro laboratorio ha demostrado que el CRHR1 estimulado por CRH, activa ERK1/2 en dos fases mediante mecanismos diferentes y presenta una señalización sostenida de la respuesta de AMPc mediada por una adenilil ciclasa soluble (sAC) en entornos neuronales. La fase más tardía de ERK1/2 en este entorno celular depende de la endocitosis y se efectúa desde los endosomas. Decidimos ampliar estos conocimientos al otro receptor de CRH en el cerebro, el CRHR2α. En este trabajo nos focalizamos en estudiar con profundidad las vías de señalización activadas por el CRHR2α en un entorno celular neuronal ya que la mayoría de los trabajos con los que contamos hoy en día se han realizado en líneas celulares periféricas. Para responder a esto, generamos un sistema celular utilizando la línea celular neuronal hipocampal de ratón HT22 que expresa de manera estable el CRHR2α. Por otro lado, de manera comparativa, utilizamos las células de insulinoma de ratón MIN6 que expresan los receptores de CRH de manera endógena y que corresponden a un entorno celular periférico (células β pancreáticas). En primer lugar, utilizando diferentes herramientas de biología molecular, describimos el perfil de activación de ERK1/2 al estimular el CRHR2α utilizando diferentes ligandos. A su vez, demostramos que el ERK1/2 se activa río abajo del AMPc que proviene de ambas fuentes generadoras (tmACs y sAC) en el entorno celular hipocampal, mientras que en las células MIN6, el perfil de activación de ERK1/2 es similar pero la estimulación del CRHR2α no evoca la respuesta del segundo mensajero. Caracterizamos además la respuesta de Akt y de CREB gatillada por las UCNs mediante el CRHR2α, siendo la fosforilación de Akt dependiente sólo del AMPc generado por sAC, y CREB dependiente de ambas fuentes de AMPc. Por otro lado, las UCNs son capaces de generar un aumento en la actividad de PKA en las células HT22-CRHR2α. El aumento en la fosforilación tanto de CREB como de ERK1/2 dependen de esta quinasa, mientras que sobre Akt tiene un efecto inhibitorio. A su vez describimos la inducción en la expresión de c-fos generada por ambos receptores de CRH, tanto en las células HT22 como el cultivo primario de neuronas de hipocampo y de corteza. En segundo lugar, observamos cambios morfológicos en las células HT22-CRHR2α evocados por la activación del CRHR2α dependiente del ligando, ya que las UCN1 y 3 son capaces de generarlos mientras que la UCN2 no tiene esta capacidad. Sólo el AMPc generado por sAC participa en este proceso de diferenciación, así como también participa la PKA/CREB y probablemente c-fos. Finalmente, nos propusimos estudiar el tránsito del CRHR2α en las células HT22. Observamos un comportamiento particular, donde en condiciones basales el receptor se encuentra mayormente dentro de la célula, luego de 6 minutos de estímulo la cantidad en membrana aumenta y luego de 30 minutos vuelve a niveles basales. En base a este resultado profundizamos el estudio en la endocitosis y el reciclado del receptor, donde al bloquear ambos procesos, aumenta la activación de ERK1/2 y disminuye la de Akt, lo que nos sugiere un posible crosstalk entre estos efectores. 2021-03-22 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/acceptedVersion http://ridaa.unq.edu.ar/handle/20.500.11807/2914 spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ application/pdf Universidad Nacional de Quilmes |
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