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Obtención de desoxinucléosidos y desoxinucleótidos mediante el uso de biocatalizadores

Fil: Valino, Ana Laura. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Biocatálisis y Biotransformaciones; Argentina.

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Main Author: Valino, Ana Laura
Other Authors: Lewkowicz, Elizabeth Sandra
Format: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Language:spa
Published: Universidad Nacional de Quilmes 2013
Subjects:
Enzimas
Catalizadores
Nucleósidos
Nucleótidos
Biocatálisis
Enzymes
Catalysts
Nucleosides
Nucleotides
Biocatalysis
Catalisadores
Nucleosídeos
Nucleotídeos
Biocatálise
Online Access:http://ridaa.unq.edu.ar/handle/20.500.11807/360
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spelling ir-20.500.11807-3602022-10-12T17:39:35Z Obtención de desoxinucléosidos y desoxinucleótidos mediante el uso de biocatalizadores Valino, Ana Laura Lewkowicz, Elizabeth Sandra Allegretti, Patricia Ercilia Orden, Alejandro Agustín Parisi, Gustavo Daniel Enzimas Catalizadores Nucleósidos Nucleótidos Biocatálisis Enzymes Catalysts Nucleosides Nucleotides Biocatalysis Catalisadores Nucleosídeos Nucleotídeos Biocatálise Fil: Valino, Ana Laura. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Biocatálisis y Biotransformaciones; Argentina. El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue desarrollar metodologías de preparación de desoxinucleósidos y desoxinucleótidos a partir de sustratos económicos, como ribósidos y azúcares, utilizando biotransformaciones con células bacterianas y enzimas, mediante procesos que involucren condiciones compatibles con el medio ambiente. El primer capítulo está enfocado a la descripción de las aplicaciones de los nucleósidos. También se presentan las ventajas que implica el uso de biotransformaciones respecto a la síntesis química tradicional y se describen las metodologías más utilizadas en la síntesis de nucleósidos. En el segundo capítulo se presenta la definición del problema que dio origen al objetivo planteado en este trabajo. Luego se describe el objetivo particular y se plantean los caminos multienzimáticos propuestos para llevarlo a cabo mostrando reacciones modelo. El tercer capítulo describe una estrategia de síntesis biocatalizada de uridina 5’- monofosfato. En primer lugar se realiza una introducción sobre el tema y se presenta la parte experimental con las metodologías específicas empleadas en esta parte del trabajo. En particular, para la síntesis de uridina 5’-monofosfato, se utilizaron células enteras de Corynebacterium ammoniagenes ATCC 19350 como biocatalizador, dado que existían antecedentes sobre el empleo de varias cepas de dicho género en la síntesis de diversos nucleótidos tanto purínicos como pirimidínicos. Se evaluaron diferentes métodos de cultivo del biocatalizador, distintos materiales de partida así como diversas condiciones experimentales de la biotransformación de manera de optimizar los resultados alcanzados. Se determinó la presencia de UMP lográndose buenos resultados y las mezclas de reacción obtenidas se utilizaron para la síntesis de uridina 5’-difosfato, desarrollada en el Capítulo 5. En el Capítulo 4 se describe la síntesis de uridina 5’-monofosfato utilizando células enteras de enterobacterias con actividad fosfatasa ácida no-específica. En primer lugar se realiza una introducción sobre el tema y luego se presenta la parte experimental. Posteriormente se describe la selección de microorganismos con actividad NSAP con las cuales se ensayó, no sólo la síntesis de UMP, sino también de timidina 5’-monofosfato, adenínarabinosido 5’-monofosfato y diversos azúcares fosfato a partir de los correspondientes nucleósidos y azúcares, con buenos resultados. Finalmente, se utilizaron dos microorganismos genéticamente modificados, desarrollados previamente en nuestro laboratorio, para la obtención biocatalizada de los productos de interés, obteniéndose resultados satisfactorios logrando reducir los tiempos de reacción de forma consideradable. En particular, las mezclas de reacción obtenidas para la síntesis de UMP se utilizaron para la producción de uridina 5’-difosfato, desarrollada en el Capítulo 5. En el Capítulo 5 y continuando con el camino multienzimático planteado en los objetivos, se propuso a modo de introducción el uso de Saccharomyces cerevisiae como biocatalizador. Este microorganismo es una fuente importante de nucleósido monofosfato quinasas, con lo cual su uso para la obtención de diferentes NDP, resulta de potencial utilidad. Luego de detallar la metodología de trabajo, se desarrollaron los resultados. Los mismos muestran que se logró sintetizar UDP a partir de un extracto de levadura utilizando UMP como sustrato, mediante una metodología sencilla y en condiciones de reacción suaves, logrando buenos rendimientos. Del mismo modo, el sistema biocatalítico se aplicó a la síntesis de otros nucleósidos, desoxinucleósidos y arabinósidos 5’-difosfato con resultados positivos. Posteriormente se evaluaron las variables que podían influir sobre esta reacción al emplear las mezclas provenientes de la síntesis de UMP, desarrolladas en los Capítulos 3 y 4, a partir de sustratos más económicos y mediante reacciones multienzimáticas one-pot. Finalmente se acondicionaron las mezclas obtenidas durante el desarrollo de dichos capítulos y se ensayó la síntesis de UDP, lográndose resultados satisfactorios, equivalentes a los obtenidos al utilizar UMP comercial. En el Capítulo 6 se realizó un screening de bacterias, particularmente del género Escherichia, que funcionen como biocatalizadores para la síntesis de desoxinucleótidos, en particular de 2’-desoxiuridina 5’-difosfato, mediante una ruta que incluye la enzima ribonucleósido reductasa (RNR), a partir de uridina 5’-difosfato como sustrato. No se lograron resultados positivos ya que no se pudo determinar la presencia de dUDP así como tampoco de dUMP, como subproducto de reacción. Sin embargo, en el momento de finalización de escritura de esta Tesis, mediante un análisis más fino de los cromatogramas obtenidos, se determinó la presencia de otro posible subproducto de reacción, en este caso desoxiuridina, utilizando E. coli ATCC 23513 como biocatalizador. Esto nos incentivó a continuar, próximamente, con un análisis más profundo de esta mezcla para poder determinar la presencia y confirmar la identidad de este compuesto. En el Capítulo 7 se utilizó una estrategia alternativa para la síntesis de desoxirribonucleósidos respecto a la desarrollada en las secciones anteriores. Para ello, en una primera parte se describen, a modo de introducción, las enzimas involucradas en el camino multienzimático propuesto, así como la posterior exposición de la parte metodológica. Luego se presentan los resultados, describiendo la selección de microorganismos, mediante un screening sobre diversos géneros bacterianos, capaces de sintetizar dR5P por acción de la enzima 2-desoxirribosa 5-fosfato aldolasa. En particular, se identificó a Erwinia carotovora ATCC 33260 como un biocatalizador novedoso que generó 14.1 mM de DR5P a partir de glucosa como materia prima, sustrato cuyo valor comercial es sustancialmente menor al del D-gliceraldehído 3-fosfato, sustrato natural de la enzima. Posteriormente, se acoplaron dos enzimas, una fosfopentomutasa y una nucleósido fosforilasa para la síntesis de desoxinucleósidos pirimidínicos como timidina, 2’- desoxiuridina y 5-bromo-2’-desoxiuridina, utilizando como sustrato de partida dR5P preparada en la primera parte de este capítulo, obteniéndose resultados positivos y cumpliendo así con los objetivos propuestos. 2013-12-18 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/acceptedVersion http://ridaa.unq.edu.ar/handle/20.500.11807/360 spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ application/pdf Universidad Nacional de Quilmes
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